说明

本文为Nanopore碱基识别及质控简明教程，正文将使用到如下软硬件：

• GPU计算型GN7 | GN7.5XLARGE80实例：腾讯云提供的实例，本教程利用该实例搭建测试环境（本测试使用的CentOS 7.5 64位操作系统）。
• NVIDIA Tesla 驱动：显卡驱动是硬件与系统沟通的软件配套。
• CUDA计算框架：NVIDIA 推出的只能用于自家GPU的并行计算框架。
• Guppy软件：Nanopore官方提供的碱基识别软件。
• MinIONQC脚本：质控脚本。

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Nanopore测序背景

测序原理

纳米孔是一个纳米级的小孔，在其设备中，Oxford Nanopore 使离子电流通过纳米孔，并测量当生物分子通过或靠近纳米孔时的电流变化。由于纳米孔的直径非常细小，仅允许单个核酸聚合物通过，而ATCG单个碱基的带电性质不一样，因此不同碱基通过蛋白纳米孔时对电流产生的干扰不同，通过实时监测并解码这些电流信号便可确定碱基序列，从而实现测序。

图片来源：Oxford Nanopore Technologies官网

Nanopore优势

• 超长读长：MinION用户迄今为止报告的最长读取长度为>4 Mb。
• 便携快捷：设备轻巧，文库制备快速。
• 直接测序：不同于Illumina及Pacbio的光学测序系统，Nanopore是基于电学信号的检测，可省去扩增，规避了扩增偏好性的风险，直接读取DNA/RNA分子电信号来分析碱基类型，亦提供了表观遗传学分析的机会。
• 实时测序：与在运行结束时批量交付数据的传统测序技术不同，纳米孔技术提供的是动态、实时的测序。

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前置驱动及软件安装

GPU Tesla驱动安装

1. 底层模块检查：

rpm -qa | grep -i dkms

rpm -qa | grep kernel-devel

rpm -qa | grep gcc

如未能找到，则参考如下命令安装：

yum install -y dkms

yum install -y kernel-devel

yum install -y gcc

#或yum install -y dkms kernel-devel gcc

2. 下载驱动：

wget https://us.download.nvidia.com/tesla/510.47.03/NVIDIA-Linux-x86\_64-510.47.03.run

细节可参考：https://cloud.tencent.com/document/product/560/8048

3. 安装驱动：

chmod +x NVIDIA-Linux-x86_64-418.126.02.runsh NVIDIA-Linux-x86_64-418.126.02.run

4. 验证：

nvidia-smi
#监控GPU使用情况

如返回信息类似下图中的 GPU 信息，则说明驱动安装成功。

CUDA框架部署

1. 框架下载

wget https://developer.download.nvidia.com/compute/cuda/11.6.2/local_installers/cuda-repo-rhel7-11-6-local-11.6.2_510.47.03-1.x86_64.rpm

细节可参考：https://cloud.tencent.com/document/product/560/8064

2. 安装框架

rpm -i cuda-repo-rhel7-11-6-local-11.6.2_510.47.03-1.x86_64.rpm
yum clean all
yum -y install nvidia-driver-latest-dkms cuda
yum -y install cuda-drivers

Guppy部署

1. Guppy下载

wget https://mirror.oxfordnanoportal.com/software/analysis/ont-guppy_6.0.1_linux64.tar.gz

2. Guppy解压及配置

tar xf ont-guppy\_6.0.1\_linux64.tar.gz  
#可直接配置到工作环境环境中~/.bashrc
#本示例解压在/home目录下，可自行替换实际软件路径
#export PATH="/home/ont-guppy/bin:$PATH"

MinIONQC部署

1. 前置R及R包部署

yum install R
Rscript -e "install.packages(c('ggplot2','viridis','plyr','reshape2','readr','yaml','scales','futile.logger','data.table','optparse'), repos='https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/CRAN/')"

2. 下载R脚本

wget https://raw.githubusercontent.com/roblanf/minion_qc/master/MinIONQC.R -O MinIONQC.R

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数据准备

本次的测试数据来源于NCBI的PRJNA812612项目的开放数据集，github上有作者的model JSON文件及分析脚本，感兴趣的可以自行前往（https://github.com/DamLabResources/HIV-Quasipore-basecallers）。

1. 下载地址：

2. 数据下载

wget https://sra-pub-src-2.s3.amazonaws.com/SRR18215551/JLat_106_MinION_R941.fast5.tar.gz.2
#AWS直接下载的速度较快

腾讯云的下载速度也比较给力，如下图

3. 数据解压

tar xf JLat_106_MinION_R941.fast5.tar.gz.2 

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碱基识别

Guppy核心参数说明

关于config参数，大家可以通过如下命令（列出Guppy支持的试剂盒和芯片清单），增加理解。

guppy_basecaller --print_workflows

Basecalling命令

guppy_basecaller -s /home/nanopore/normal/r9.4.1  -i /home/nanopore/data/r9.4.1/ -x cuda:0 -c dna_r9.4.1_450bps_hac.cfg 

感兴趣的可以查看GPU效能，这里可以看到用了8G的显存，显存核心利用率为100%，具体参数可以参考网上博客说明，如https://www.jianshu.com/p/ceb3c020e06b?msclkid=4dc4c38ac2c311ec99ef9b6bf6e3371a

本次Basecalling总共用了近58分钟，T4的速度比V100慢3~4倍，如果是V100，这个速度一般在20分钟以内。

本次生成70个fastq文件，大家在使用时候可以直接合并成一个文件。

cat *.fastq > AllinOne.fastq

数据质控

核心参数说明

质控命令

Rscript MinIONQC.R -i /home/nanopore/normal/r9.4.1 -q 12 -o /home/nanopore/normal/r9.4.1/qc -p 20

QC完成后，将生成一些质控图及统计文件，感兴趣的小伙伴可以到github上（https://github.com/roblanf/minion_qc

）看详细的解释说明，这里就不展开说明了。

后续的工作，大家可以根据各自需求调整或进行下游二三级分析。

参考资料

1. https://nanoporetech.net/how_it_works
2. https://nanoporetech.com/how-it-works/advantages-nanopore-sequencing
3. https://zhuanlan.zhihu.com/p/91960495
4. https://cloud.tencent.com/document/product/560/8048
5. https://cloud.tencent.com/document/product/560/8064
6. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/812612
7. https://www.jianshu.com/p/ceb3c020e06b?msclkid=4dc4c38ac2c311ec99ef9b6bf6e3371a
8. https://github.com/roblanf/minion_qc